干货满满！荧光染料大总结！（二）

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Alexa Fluor®染料

Alexa Fluor®染料是带负电荷且亲水的荧光染料系列，该系列染料囊括范围较广，且经常用于荧光显微镜技术之中。这些染料的名称是由其发明者Richard Paul Haugland 以他儿子 Alex Haugland 的名字命名的。该产品标识是 Molecular Probes（美国生命科学技术公司 Life Technologies旗下子公司，注：2014年2月Life Technologies被Thermo Fisher收购）的商标。此外，这些产品标识中也涵盖了相应的激光激发波长。例如，应用范围很广且大激发波长为 493 nm的Alexa Fluor®488，可由标准的488 nm激光激发。Alexa Fluor®488的大发射波长为 519 nm，正是因为具备上述特性，使得 Alexa Fluor®488与 FITC 的属性相似。尽管 Alexa Fluor®488是一种荧光素衍生物，但与 FITC 相反，它拥有更佳的稳定性和荧光亮度，且 pH 敏感度也更低。所有 Alexa Fluor® 染料（比如，Alexa Fluor®546、Alexa Fluor®633）都是不同基础荧光物质的磺化形式，例如，荧光素、香豆素、青色素或罗丹明，它们的摩尔质量在410 至 1400 g/mol 范围之内。

图 2：小鼠转基因胚胎、肢间体节，E10.5 小鼠转基因胚胎的 5 个肢间体节：EpaxialMyf5 eGFP；GFP-Alexa 488 免疫组化染色；用 Desmin-Cy3 对胚胎肌肉纤维进行染色，用 Hoechst Size 自上而下揭示细胞核：3.5 mm (a)，800 µm (b)。图片来源：Aurélie Jory, CellulesSouches et Développement, Institut Pasteur, Paris,France and Imaging centre of IGBMC, IGBMC。

 

图 3：小鼠成纤维细胞，绿色：F-Actin，FITC；红色：Tubulin，Cy5；蓝色：细胞核，DAPI。图片来源：德国·海德尔堡·马克斯-普朗克研究所·Günter Giese博士

 

DNA 染色

在荧光显微镜技术中，不只研究蛋白结构，核酸同样具有重要的研究意义。有时候，必须通过检测细胞核来确定细胞的精确位置及其数量。常用的一种DNA 染色剂当属 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) ，其可与DNA 双螺旋的 A-T 富集区域相结合。如果 DAPI 附着到 DNA 上，其荧光强度将比游离状态要高。该染色剂受大波长为358 nm的紫外光激发，其发射光谱非常宽，在461 nm 处达到峰值。此外，还可对弱荧光进行 RNA 结合检测。在这种情况下，发射波长将转移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能够穿透整个细胞膜。因此，它可以用于固定和活细胞之中。

第二种被广泛使用的DNA 染色剂就是 Hoechst 染料系列，这些染料原先都是由 Hoechst AG 这家化学公司生产的。Hoechst 33258、Hoechst 33342以及Hoechst 34580 均为双苯酰亚胺，可嵌入 A-T 富集区域，因此，该系列染料很少用到。与 DAPI 相似，这三种染色剂都可受大发射波长为455 nm的紫外光激发，而未被结合的染色剂，其大发射波长在 510–540 nm 之间。Hoechst 染色剂还具有细胞渗透性，因此可用于活细胞或已固定的细胞中。该染色剂与DAPI 的不同之处在于，它们的毒性较低。

碘化丙啶（Propidium-Iodide，PI）是一种不能透过细胞膜的 DNA 染色剂。由于具备上述特性，该染色剂无法进入完整的细胞中，因此，该染色剂常用于区分细胞群中的活细胞和死细胞。此外，碘化丙啶还是一种嵌入剂，但对于不同的碱基并不存在结合的差异性。该染色剂与核酸结合后，大激发波长为538 nm，大发射波长为 617 nm。未结合 PI 的大激发和发射波长和光强会更低一些。PI 还可结合 RNA，同时无需改变自身的荧光特性。有时候为了区分DNA 和 RNA，有必要使用适当的核酸酶。

不需要前期处理，吖啶橙就可以鉴别DNA 与 RNA 。吖啶橙与 DNA 结合后，大激发/发射波长为 502 nm/525 nm，而与 RNA 结合后，大激发/发射波长为460 nm/650 nm。此外，它还能够进入溶酶体等酸性区室。在这里，阳离子染料被质子化。在这种酸性环境下，吖啶橙由蓝色光谱中的光激发，但发射波长在橙色区域达到大。由于凋亡细胞具有大量被吞噬的酸性区室，因此，吖啶橙常用作此类细胞的标记物。

 

 

区室和细胞器特异性染料

在荧光显微镜技术中，往往要对溶酶体、核内体等细胞区室以及线粒体等细胞器进行染色。为此，该部分介绍了一系列可供选择使用的特异性染料。

观察线粒体常用的方法就是利用 MitoTracker®，它是一种可透过细胞的染料，包含轻度巯基化的氯甲基活性部分。正因如此，它可与半胱氨酸残基的游离硫醇基反应，从而与基质蛋白实现共价结合。MitoTracker® 有不同的颜色和修饰类型（参见表 1），此外，它还是 Molecular Probes 的商标。与罗丹明 123 (Rh123) 或 tetramethylrosamine等常规线粒体特异性染色剂不同，在用固定剂破坏膜电位后，MitoTracker®不会被洗掉。

依据线粒体染色剂，还有些染料可以标记溶酶体等酸性区室，这类染料被称为LysoTracker。它们由连接一个荧光基团的弱碱基团组成，具有膜穿透性。有可能的情况是，这些碱基因质子化作用的影响而对酸性区室具有亲和性。LysoTracker具有多种不同的颜色可供选择（参见表 1）。

与溶酶体相似的区室是酿酒酵母等真菌中的液泡，这种膜密闭空间也是一种酸性环境。如果要在荧光显微镜下观察上述区室，则要使用FM 4-64®或FM 5-95®等苯乙烯基染料。

对于蛋白质分泌实验，内质网 (ER) 具有重要的研究意义。对上述区室进行染色的一种典型染料为DiOC6(3)。该染料虽然偏好 ER，但仍会结合线粒体等其他细胞器膜。对ER 进行特异性染色的另一种方法是，使用 ER-Tracker Green 和 Red 等 ER-Tracker，而 ER-Tracker Green 和 Red 是基于 BODIPY 的两种染料，其与格列本脲（一种磺酰基脲酶）连接，并可与仅存于内质网膜上的ATP敏感性钾通道结合。BODIPY（硼-二吡咯亚甲基，boron-dipyrromethene）是一种几乎不溶于水的、对pH 相对不敏感的染料基团，该染料对蛋白质标记没太大用处，但却是脂质和膜标记的良好工具。

对于与ER相邻的高尔基体，可以用 NBD C6-ceramide 和BODIPYFL C5-ceramide 等荧光神经酰胺类似物对其进行标记。 上述神经酰胺为鞘脂类，其在高尔基体中高度富集。

借助基于脂质的染料，可以对脂筏等特异膜区域进行染色。使用 NBD-6Cholestrol或NBP-12 Cholesterol 可以观察胆固醇富集区域（Avanti Polar Lipids）。

除了使用特异性非蛋白荧光染料对细胞区室进行标记之外，还可以借助对细胞中不同位置有偏好的蛋白质对目标区域进行染色。这些蛋白质可以和荧光染料相连，并可通过荧光显微镜进行观察。运用这种方法的一个实例是：麦胚凝集素(WGA) 可以与细胞质膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特异性结合，将WGA 与荧光染料偶联，这样我们就可以观察到细胞质膜了。

图 4：Pukinje细胞，小鼠小脑皮质三重标记的纵侧截面图。红色：anti-calbindin-D28k/Cy3；绿色：anti-GFAP/Cy5；蓝色：Hoechst 33258

 

图 5：牛肺部内皮细胞。红色：用 MitoTracker®Red CMXRos 标记的线粒体；绿色：用绿色荧光 BODIPY®FLphallacidin 标记的纤维状肌动蛋白；蓝色：用 DAPI 标记的细胞核。使用三维盲反褶积可以改善该图像的质量。